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师兄带你一文读懂「酶标仪」真的很酷！

来源：tvt体育app下载发布时间：2025-01-31 09:24:50

人们只所以能看到色彩，是因为光照射到物体上被物体反射回来。绿色植物之所以是绿色，是因为植物吸收了光中的红色光谱。酶标仪测定的原理是在特定波长下，检测被测物的吸光值。

光是电磁波，波长100nm-400nm称为紫外光，400nm-780nm之间的光可被人眼观察到，大于780nm称为红外光。人们只所以能清楚看到色彩，是因为光照射到物体上被物体反射回来。绿色植物之所以是绿色，是因为植物吸收了光中的红色光谱。酶标仪测定的原理是在特定波长下，检测被测物的吸光值。

酶标仪，即酶联免疫检测仪，用来检测ELISA反应后的吸光度值，主要由光路系统与信号采集系统组成。工作原理为：

光源灯发出的光波经过滤光片或单色器变成一束单色光，该单色光一部分被标本吸收，另一部分则透过标本照射到光电检测器上;

分为滤光片式酶标仪(固定波长酶标仪)、光栅式酶标仪(全波长酶标仪)，这两种都是属于光吸收酶标仪;

滤光片是光学玻璃片镀制光学膜层，使滤光片对通过的波长发生明显的变化，将不需要的波长光隔开。根据选配的滤光片，只能截取特定波长进行检测。

光栅型是使用物理性衍射光栅原理在不同角度将白光光源分开，再通过一系列狭缝将已选取的激发波长分出来。光栅型酶标仪可以截取光源波长范围内的任意波长，灵活度更高。

目前滤光片系统因价格较为便宜，检验测试灵敏度高，带宽的可选择性强，能够直接进行快速的滤光片切换等优点，其应用更广。

光电检测以采用纯度高的光为佳，但不管采用哪种分光器，都不可能得到绝对纯的光。

滤光片：经滤光片分光后，通过透光孔被比色皿所接受的光也是一个波段，但在指定波长上光的强度最高，呈正态分布。

滤光片有很好的透光率 (可高于85%)，也就是说光能量的损失比较少。在一个荧光检测中，经过滤光片进入样本的激发光和从样本透过滤光片进入检测器的发射光都只有少量的损失(大约10%)。光的损失较少，光的能量自然较大，荧光的信号自然很容易检测。这是获得高信噪比(SNR)的最初始保证。所以，由于有高的信噪比(SNR)保证，滤光片系统从酶标仪诞生以来一直就是高灵敏度检测的黄金标准。我们也显而易见很多有光栅型酶标仪的厂家在一些检测灵敏度要求比较高的高端应用(如：TRF、TR-FRET、等)中，都会有另外配上滤光片模块的设计。因为这些高端的应用，光栅系统未能有满意的效果或干脆做不到。

光栅系统带来方便，但也有一些缺点。基于光路设计的问题，光栅的光能损失比滤片大很多。在荧光检测中，光源经过光栅而成的激发光已比原来的少了能量。样本被激发后会放出发射光，发射光会透过光栅去分隔出需要的波长。被分隔后的发射光能量再损失。光栅酶标仪的灵敏度没有滤光片酶标仪好的，所以在高端光栅型的酶标仪也要配备滤光片模块才能进行TRF、TR-FRET等高灵敏度需求的检测。

可分为单功能酶标仪(分为光吸收、荧光、化学发光等)和多功能酶标仪。多功能酶标仪是以上两种或更多检测模块的集成，通常情况下至少可提供光吸收、荧光这两种最常见检测功能，而一些中高端多功能酶标仪还可支持化学发光、时间分辨荧光、荧光偏振、生物发光共振能量转移，甚至还能支持“Western Blot”和“上转换发光”等检测。

光通过被检测物，前后的能量差异即是被检测物吸收掉的能量，特定波长下，同一种被检测物的浓度与被吸收的能量成定量关系。

E=OD=logⅠ0/Ⅰ其中E表示被吸收的光密度，Ⅰ0为在检测物之前的光强度，Ⅰ为从被检测物出来的光强度。

但是每一种物质对光能量还存在一定的非特异性吸收，为了消除这种非特异性吸收，我们再选取一个参照波长，以消除这个不准确性。在参照波长下，检测物光的吸收最小。检测波长和参照波长的吸光值之差可以消除非特异性吸收。

一般酶标仪的测定波长在400～750nm或800nm之间，可完全满足ELISA的显色测定。

当pH值降为4.0时，最大吸收波长移至492 nm，同时摩尔消光系数变大，显色加深，因而常用强酸如硫酸或盐酸终止反应。

TMB的氧化产物联苯醌在波长450nm处有最大消光系数，如果HRP量少，H：O：和TMB过量时，则形成蓝色的阳离子根。

降低pH，即可使蓝色的阳离子根转变为黄色的联苯醌，使用硫酸作为终止剂可使产物稳定90min。

450nm和492nm两个波长是目前ELISA测定最常用的，考虑到双波长比色的需要，还应有630nm和405nm波长的滤光片。

而“双波长”则除了用对显色具最大吸收的波长即450nm或492nm进行比色测定外，同时用对特异显色不敏感的波长如630nm进行测定，酶标仪最后打印出来的吸光度则为二者之差。

630nm波长下得到的吸光度是非特异的，来自于板孔上诸如指纹、灰尘、脏物等所致的吸收。因此，在ELISA比色测定中，最好使用双波长，且不必设空白孔。

通常，酶标仪的吸光度测定范围在0～2.5之间即能够完全满足ELISA的测定要求。早期的酶标仪可测定的吸光度一般在0～2.5之间，但现在大多数都做了拓宽，可达到3.5以上，并且能保持很好的精密度与线性。因此，对于酶标仪的吸光度范围不必去特意追求大的吸光度范围，主要看在一定的吸光度范围内的线性和精密度如何

酶标仪的震板功能是指酶标仪在对ELISA板孔进行比色测定前对其进行振荡混匀，使板孔内颜色均一。目前市场上常见的酶标仪均有震板功能，不一样的是震板方式，有的可按上下、左右或旋转等方式及振荡幅度等任意调节。使用有震板功能的酶标仪，在进行ELISA测定，显色反应完成加入终止液后，可不必振荡混匀，直接放入酶标仪测定即可。

软件功能是指酶标仪所具有的对ELISA定性和定量测定及其他测定方式如酶标动力学、紫外和凝集等数据的统计分析并报告结果的功能。软件功能是中高档酶标仪的一个很重要的功能。

软件在读数前可设置读数孔、波长、计算公式等内容，在读数后显示有关数据。对于用户来说，好的软件功能，对实际在做的工作会有较大的帮助。ELISA定性测定，酶标仪如具有阳性判断值(cut-off)及其测定“灰区”(即指测定吸光度处于cut—off周围的一定区域，此区域内结果应为“可疑”)的统计计算功能，不但方便了实验室工作人员，而且在某些特定的情况下，有很高的实用价值。

★感染免疫室检测：乙肝五项(HBV)、甲肝抗体(HAV)、戊肝抗体(HEV)、丙肝抗体(HCV)、免疫球蛋白(IgG)、艾滋病抗体(HIV)、梅毒螺旋体抗体......

★过敏原检测：血清总IgE、特异性IgE及过筛试验、ECP检查......

★肿瘤标志物的检测：癌胚抗原(CEA)、甲胎蛋白(AFP)、前列腺特异性抗原(PSA)、糖类抗原(CA199)、糖类抗原(CA125)、糖类抗原(CA153)、鳞状细胞癌抗原(SCC)......

★生殖医学检测：弓形虫、风疹病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒I型和II型、抗抗体、抗子宫内膜抗体、抗卵巢抗体、抗滋养膜细胞抗体、抗hCG抗体......

★黄曲霉素;贝类毒素;呕吐毒素;黄曲霉毒素B1;玉米赤霉烯酮;赭曲霉毒素A。

★植物CIQ：番茄黑环病毒检测、豇豆重花叶病毒(碱性磷酸酶标记405 nm)。

测定450nm吸光度：建议采用双波长进行测定，检测波长450-490nm，参比波长600-650nm。

★具体应用：谷丙转氨酶(ALT)的检测(肝功能) 、尿素氮的检测(脲酶-NADH法)(肾功能)、葡萄糖6磷酸脱氢酶的检测(溶血病)、已糖激酶(血清葡萄糖)。